Russian Journal of Biological Physics and Chemisrty Russian Journal of Biological Physics and Chemisrty АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ И ХИМИИ 2499-9962 54105 БИООРГАНИЧЕСКАЯ, БИОФИЗИЧЕСКАЯ И МЕДИЦИНСКАЯ ХИМИЯ BIOORGANIC, BIOPHYSICAL AND MEDICINAL CHEMISTRY БИООРГАНИЧЕСКАЯ, БИОФИЗИЧЕСКАЯ И МЕДИЦИНСКАЯ ХИМИЯ MTT DEPOLARIZE MITOCHONDRIA IN CULTURED NEURONS MTT ДЕПОЛЯРИЗУЕТ МИТОХОНДРИИ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ НЕЙРОНАХ Шарипов Р Р Sharipov R R Лисина О Ю Lisina O Yu Красильникова И А Krasilnikova I A Вышенская Т В Vyshenskaya T V Пинелис В Г Pinelis V G Сурин А М Surin A M ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» ru Institute of General Pathology and Pathophysiology ru ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии»; Московский технологический университет ru Institute of General Pathology and Pathophysiology; Moscow Technological Institute ru ФГАУ «Научный центр здоровья детей» Минздрава России ru Scientific Center for Children’s Health, Ministry of Health of the Russia ru Московский технологический университет ru Moscow Technological Institute ru ФГАУ «Научный центр здоровья детей» Минздрава России ru Scientific Center for Children’s Health, Ministry of Health of the Russia ru ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии»; ФГАУ «Научный центр здоровья детей» Минздрава России; Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова ru Institute of General Pathology and Pathophysiology; Scientific Center for Children’s Health, Ministry of Health of the Russia; Pirogov Russian National Research Medical University ru 25 12 2016 25 12 2016 1 2 218 223 20 12 2016 20 12 2016 https://rusjbpc.ru/en/nauka/article/54105/view

МТТ-анализ - один из наиболее используемых методов определения выживаемости клеток в культуре при различных фармакологических воздействиях. Внутриклеточные дегидрогеназы восстанавливают МТТ (3-(4,5-диМетилТиазол-2-ил)-2,5-дифенилТетразолий бромид) до формазана, который сильно поглощает свет области короче ~600нм. Формазан образует агрегаты и обнаруживается в клетках по появлению темных «зерен». В настоящей работе выполнено исследование влияния МТТ на митохондриальный потенциал (ΔΨm) и поглощение света в культивируемых нейронах мозжечка крысы методами световой микроскопии. Изменения потенциала регистрировали с помощью флуоресцентного потенциал-чувствительного зонда родамин 123 (Rh123). Добавление МТТ (0,1мМ) вызывало быстрое и практически полное тушение флуоресценции Rh123, которое через 5-10 мин сменялось ростом флуоресценции в нуклеоплазме. Зонд выходил из митохондрий в цитозоль с последующей диффузией в ядро, что является характерным признаком падения ΔΨm. Столь же быстрым было тушение флуоресценции митотрекера зеленого (MTG), которое не сменялось ростом флуоресценции, поскольку MTG связывается с митохондриями необратимо. Рост флуоресценции Rh123 совпадал с началом снижения интенсивности света, проходящего сквозь клетки, в результате образования формазана. МТТ вызывал также необратимое снижение автофлуоресценции нейронов, обусловленной NADH. Восходящая фаза сигнала Rh123 и снижение интенсивности проходящего сквозь клетки света отражает, вероятно, прекращение окисления NADH комплексом 1 дыхательной цепи вследствие того, что NADH тратится на восстановление МТТ до формазана. В итоге прекращается работа комплекса 1 дыхательной цепи и развивается деполяризация митохондрий. Полученные результаты указывают на то, что МТТ (при концентрациях 0,1мМ и выше) вызывает быструю дисфункцию митохондрий и поэтому следует относиться с осторожностью к интерпретации данных о выживаемости клеток и активности дегидрогеназ на основании количества формазана, образовавшегося при инкубации клеточных культур с МТТ.

MTT assay is one of the widespread methods of determining the viability of cells in culture with different pharmacological treatment. Intracellular dehydrogenases reduce MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) to formazan, which absorbs light in the spectral region <600nm. Formazan forms aggregates in the cells which appeared as dark spots. In the present work, we performed a light microscopy study on the impact of MTT on mitochondrial potential (ΔΨm) and the light absorption by cultured neurons from rat cerebellum. Changes of ΔΨm were recorded employing fluorescent potential-sensitive probe rhodamine123 (Rh123). Application of MTT (0.1mM) caused a rapid and almost complete quenching of fluorescence Rh123, followed by (in 5-10 min) fluorescence increase in the nucleoplasm. Rh123 diffused out of the mitochondria to the cytosol followed by diffusion into the nucleus, which is a characteristic feature of the ΔΨm fall. Equally rapid has been quenching of the MitoTrecker Green (MTG) fluorescence, however without subsequent fluorescence increase, because MTG irreversibly binds to mitochondria. Growth of Rh123 fluorescence coincided with the beginning of absorbtion of light passing through the cells, due to formation of formazan. MTT also caused irreversible reduction in the neuronal NADH autofluorescence. Rising phase of the Rh123 signal and decrease of the cell culture light transmittance likely reflects restriction of NADH oxidation by respiratory chain complex 1 because NADH is spent on the restoration of MTT to formazan. As a result, operation of the complex 1 is ceased and mitochondrial depolarization develops. The results obtained suggest that the MTT (at concentrations of 0.1 mM and above) causes rapid mitochondrial dysfunction and therefore should be treated with caution in the interpretation of data concerning cell survival and dehydrogenase activity based on the amount of formazan formed during the incubation of cell cultures with MTT.

 нейроны митохондриальный потенциал флуоресцентная микроскопия МТТ neurons mitochondrial potential fluorescence microscopy MTT

Bellamy W.T. Prediction of response to drug therapy of cancer. A review of in vitro assays. Drugs. 1992, vol. 44, no. 5, pp. 690-708. Bellamy W.T. Prediction of response to drug therapy of cancer. A review of in vitro assays. Drugs. 1992, vol. 44, no. 5, pp. 690-708. Galluzzi [et al.] Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ., 2009, vol. 16, no. 8, pp.103-107. Galluzzi [et al.] Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ., 2009, vol. 16, no. 8, pp.103-107. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods., 1983, vol. 65, pp. 55-63. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods., 1983, vol. 65, pp. 55-63. Denizot F., Lang R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability J. Immunol. Methods, 1986, vol. 89, pp. 271-277. Denizot F., Lang R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability J. Immunol. Methods, 1986, vol. 89, pp. 271-277. Duchen M.R., Surin A.M., Jacobson J. Imaging mitochondrial function in intact cells. Methods in Enzymology, 2003, vol. 361, pp. 353-389. Duchen M.R., Surin A.M., Jacobson J. Imaging mitochondrial function in intact cells. Methods in Enzymology, 2003, vol. 361, pp. 353-389. Khodorov B. Glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurones. Prog. Biophys. Mol. Biol., 2004, vol. 86, no. 2, pp. 279-351. Khodorov B. Glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurones. Prog. Biophys. Mol. Biol., 2004, vol. 86, no. 2, pp. 279-351. Lukyanova L.D. Mitochondrial Signaling in Hypoxia. Open Journal Endocrine Metabolic Diseases, 2013, vol. 3, pp. 20-32. Lukyanova L.D. Mitochondrial Signaling in Hypoxia. Open Journal Endocrine Metabolic Diseases, 2013, vol. 3, pp. 20-32. Сурин А.М., Горбачева Л.Р., Струкова С.М., Пинелис В.Г., Сторожевых Т.П. Флуоресцентно-микроскопические методы оценки функционального состояния и выживаемости нейронов. Руководство к экспериментальным работам по физиологии, 2009, с. 141-187. [Surin A.M., Gorbacheva L.R., Strukova S.M., Pinelis V.G., Storozhevykh T.P. Fluorescence microscopy methods for assessing functional status and survival of neurons. Guide to the experimental work on the physiology, 2009, pp.141-187. (In Russ.)] Surin A.M., Gorbacheva L.R., Strukova S.M., Pinelis V.G., Storozhevyh T.P. Fluorescentno-mikroskopicheskie metody ocenki funkcional'nogo sostoyaniya i vyzhivaemosti neyronov. Rukovodstvo k eksperimental'nym rabotam po fiziologii, 2009, s. 141-187. [Surin A.M., Gorbacheva L.R., Strukova S.M., Pinelis V.G., Storozhevykh T.P. Fluorescence microscopy methods for assessing functional status and survival of neurons. Guide to the experimental work on the physiology, 2009, pp.141-187. (In Russ.)] Berridge M.V., Tan A.S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Arch Biochem Biophys, 1993, vol. 303, no. 2, pp. 474-482 Berridge M.V., Tan A.S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Arch Biochem Biophys, 1993, vol. 303, no. 2, pp. 474-482 Goodwin C.J., Holt S.J., Riley P.A. [et al.] Growth hormone-responsive DT-diaphorase-mediated bioreduction of tetrazolium salts, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, vol. 226, pp. 935-941. Goodwin C.J., Holt S.J., Riley P.A. [et al.] Growth hormone-responsive DT-diaphorase-mediated bioreduction of tetrazolium salts, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, vol. 226, pp. 935-941. Tarpey M.M., Fridovich I. Methods of Detection of Vascular Reactive Species Nitric Oxide, Superoxide, Hydrogen Peroxide, and Peroxynitrite. Circ. Res., 2001, vol. 89, pp. 224-236. Tarpey M.M., Fridovich I. Methods of Detection of Vascular Reactive Species Nitric Oxide, Superoxide, Hydrogen Peroxide, and Peroxynitrite. Circ. Res., 2001, vol. 89, pp. 224-236. Bernas T., Dobrucki J.W. The role of plasma membrane in bioreduction of two tetrazolium salts, MTT, and CTC. Arch. Biochem. Biophys. 2000, vol. 380, pp. 108-116. Bernas T., Dobrucki J.W. The role of plasma membrane in bioreduction of two tetrazolium salts, MTT, and CTC. Arch. Biochem. Biophys. 2000, vol. 380, pp. 108-116. Liu Y., Peterson D.A., Kimura H., Schubert D. Mechanism of cellular 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction, J. Neurochem. 1997, vol. 69, pp. 581-593. Liu Y., Peterson D.A., Kimura H., Schubert D. Mechanism of cellular 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction, J. Neurochem. 1997, vol. 69, pp. 581-593. Stepanenko A.A., Dmitrenko V.V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene, 2015, vol. 574, no. 2, pp. 193-203. Stepanenko A.A., Dmitrenko V.V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene, 2015, vol. 574, no. 2, pp. 193-203. Grela E., Ząbek A., Grabowiecka A. Interferences in the optimization of the MTT assay for viability estimation of proteus mirabilis. Avicenna J Med Biotechnol., 2015, vol. 7, no. 4, pp. 159-167. Grela E., Ząbek A., Grabowiecka A. Interferences in the optimization of the MTT assay for viability estimation of proteus mirabilis. Avicenna J Med Biotechnol., 2015, vol. 7, no. 4, pp. 159-167. Ward M.W., Rego A.C., Frenguelli B.G., Nicholls D.G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells, J Neurosci, 2000, vol. 20, no. 19, pp. 7208-7219. Ward M.W., Rego A.C., Frenguelli B.G., Nicholls D.G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells, J Neurosci, 2000, vol. 20, no. 19, pp. 7208-7219. Buckman J.F., Hernández H., Kress G.J., Votyakova T.V., Pal S., Reynolds I.J. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. J Neurosci Methods, 2001, vol. 104, no. 2, pp. 165-176. Buckman J.F., Hernández H., Kress G.J., Votyakova T.V., Pal S., Reynolds I.J. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. J Neurosci Methods, 2001, vol. 104, no. 2, pp. 165-176. Marshall N.J., Goodwin C.J., Holt S.J. A critical assessment of the use of microculture tetrazolium assays to measure cell growth and function. Growth Regul., 1995, vol. 5, pp. 69-84. Marshall N.J., Goodwin C.J., Holt S.J. A critical assessment of the use of microculture tetrazolium assays to measure cell growth and function. Growth Regul., 1995, vol. 5, pp. 69-84. Нарциссов Р.П. Анализ изображения клетки - следующий этап развития клинической цитохимии в педиатрии. Педиатрия. Журнал им. Г.Н.Сперанского, 1998, т. 77, № 4, с. 101-105. [Narcissov R.P. Analysis of cell imaging - the next stage of clinical cytology in pediatrics. Pediatriya. Zhurnal im. G.N. Speranskogo, 1998, vol. 77, no. 4, pp. 101-105 (In Russ.)] Narcissov R.P. Analiz izobrazheniya kletki - sleduyuschiy etap razvitiya klinicheskoy citohimii v pediatrii. Pediatriya. Zhurnal im. G.N.Speranskogo, 1998, t. 77, № 4, s. 101-105. [Narcissov R.P. Analysis of cell imaging - the next stage of clinical cytology in pediatrics. Pediatriya. Zhurnal im. G.N. Speranskogo, 1998, vol. 77, no. 4, pp. 101-105 (In Russ.)] Nicholls D.G., Budd S.L. Mitochondria and neuronal survival, Physiol. Rev., 2000, vol. 80, pp. 315-360. Nicholls D.G., Budd S.L. Mitochondria and neuronal survival, Physiol. Rev., 2000, vol. 80, pp. 315-360. Закиров Р.Ш., Сорокина Е.Г., Карасёва О.В., Семёнова Ж.Б., Петричук С.В., Рошаль Л.М., Пинелис В.Г. Функциональное состояние митохондрий лимфоцитов периферической крови при черепно-мозговой травме у детей. Вестник РАМН, 2015. [Zakirov R.S., Sorokina E.G., Karaseva O.V., Semenova Zh.B., Petrichuk S.V., Roshal L.M., Pinelis V.G. Peripheral blood lymphocytes mitochondrial functional in children with traumatic brain injury. Vestnik RAMN, 2015 (In Russ.)] Zakirov R.Sh., Sorokina E.G., Karaseva O.V., Semenova Zh.B., Petrichuk S.V., Roshal' L.M., Pinelis V.G. Funkcional'noe sostoyanie mitohondriy limfocitov perifericheskoy krovi pri cherepno-mozgovoy travme u detey. Vestnik RAMN, 2015. [Zakirov R.S., Sorokina E.G., Karaseva O.V., Semenova Zh.B., Petrichuk S.V., Roshal L.M., Pinelis V.G. Peripheral blood lymphocytes mitochondrial functional in children with traumatic brain injury. Vestnik RAMN, 2015 (In Russ.)]