Russian Journal of Biological Physics and Chemisrty Russian Journal of Biological Physics and Chemisrty АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ И ХИМИИ 2499-9962 55023 10.29039/rusjbpc.2022.0523 МЕДИЦИНСКАЯ БИОФИЗИКА И БИОФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ MEDICAL BIOPHYSICS AND BIOPHYSICAL CHEMISTRY МЕДИЦИНСКАЯ БИОФИЗИКА И БИОФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ THE EFFECT OF WATER-SOLUBLE DERIVATIVES OF FULLENE C60 ON THE LEVEL OF OXIDATIVE STRESS AND ON THE TRANSCRIPTIONAL ACTIVITY OF GENES REGULATING PRO- AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF HUMAN EMBRYONIC FIBROBLAST CELLS (HELFs) IN VITRO Влияние водорастворимых производных фуллерена С60 на уровень окислительного стресса и на транскрипционную активность генов, регулирующих про- и антиоксидантную активность эмбриональных фибробластов легких человека, культивируемых in vitro Малиновская Е. М. Malinovskaya E. M. m.elena.0402@gmail.com Савинова Е. А. Savinova E. A. Сергеева В. А. Sergeeva V. A. tracytheplane@gmail.com Ершова Е. С. Ershova E. S. Проскурнина Е. В. Proskurnina E. V. proskurnina@gmail.com Каменева Л. В. Kameneva L. V. Долгих О. А. Dolgikh O. A. Вейко Н. Н. Veiko N. N. Краевая О. А. Kraevaya O. A. Жиленков А. В. Zhilenkov A. V. Трошин П. А. Troshin P. A. troshin2003@inbox.ru Костюк С. В. Kostyuk S. V. svet-vk@yandex.ru Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова Москва Россия Research Centre for Medical Genetics Moscow Russian Federation Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова Москва Россия Research Centre for Medical Genetics Moscow Russian Federation Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова Москва Россия Research Centre for Medical Genetics Moscow Russian Federation Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова Москва Россия Research Centre for Medical Genetics Moscow Russian Federation Федеральный научно-клинический центр реаниматологии и реабилитологии Москва Россия Federal Research and Clinical Center of Intensive Care Medicine and Rehabilitology Moscow Russian Federation Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова Москва Россия Research Centre for Medical Genetics Moscow Russian Federation Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова Москва Россия Research Centre for Medical Genetics Moscow Russian Federation Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова Москва Россия Research Centre for Medical Genetics Moscow Russian Federation Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова Москва Россия Research Centre for Medical Genetics Moscow Russian Federation ФИЦ ПХФ и МХ РАН Черноголовка Россия FRC PCPMC RAS Chernogolovka Russian Federation ФИЦ ПХФ и МХ РАН Черноголовка Россия FRC PCPMC RAS Chernogolovka Russian Federation ФИЦ ПХФ и МХ РАН Черноголовка Россия FRC PCPMC RAS Chernogolovka Russian Federation Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова Москва Россия Research Centre for Medical Genetics Moscow Russian Federation Федеральный научно-клинический центр реаниматологии и реабилитологии Москва Россия Federal Scientific and Clinical Center of Medical Rehabilitation and Balneology of the Federal Medical and Biological Agency of Russia Moscow Russian Federation 25 06 2022 25 06 2022 7 2 325 333 20 06 2022 20 06 2022 https://rusjbpc.ru/en/nauka/article/55023/view

В работе рассматривается влияние двух водорастворимых производных фуллерена C60, модифицированных аминокислотными остатками, на уровень активных форм кислорода (АФК) в культивируемых клетках человека и на транскрипционную активность генов, регулирующих про- и антиоксидантную активность клеток. Производные фуллерена С60 с присоединенными остатками аминокислот серина и фенибута синтезировали из хлорфуллеренов С60Cl6. В экспериментах in vitro использовали культуры эмбриональных фибробластов легких человека. Различные концентрации производных фуллерена добавляли к среде культивирования, клетки культивировали в присутствии соединений от 1 до 72 часов. Уровень АФК определяли с помощью красителя 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетата (DCFH-DA), который под действием свободных радикалов окисляется с образованием флуоресцирующего 2,7-дихлорфлуоресцеина (DCF), методами флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и с использованием планшетного ридера. Уровень экспрессии белков определяли методом проточной цитофлуориметрии с использованием специфичных антител. Уровень экспрессии генов оценивали методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Показали, что при введении изучаемых соединений в клеточную среду они интенсивно поглощают активные формы кислорода за счет двойных сопряженных связей в каркасе. При этом производные фуллерена способствуют развитию вторичного окислительного стресса в клетках через 24 часа после введения. Данный эффект происходит за счет активации фермента NОХ4. В клетках эмбриональных фибробластов легких человека, которым были введены исследуемые производные фуллерена C60, обнаружена корреляция между экспрессией белка фермента NOX4 и уровнем активных форм кислорода. Отсутствие активации антиоксидантного транскрипционного фактора NRF2 при инкубации эмбриональных фибробластов легких человека в присутствии производных фуллерена C60 способствует развитию вторичного окислительного стресса в клетках.

The paper considers the effect of two water-soluble C60 fullerene derivatives modified with amino acid residues on the level of reactive oxygen species (ROS) in cultured human cells and on the transcriptional activity of genes that regulate pro- and antioxidant activity of cells. C60 fullerene derivatives with attached serine and phenibut amino acid residues were synthesized from C60Cl6 chlorofullerenes. Human embryonic lung fibroblast cultures were used in in vitro experiments. Various concentrations of fullerene derivatives were added to the culture medium, the cells were cultured in the presence of compounds from 1 to 72 hours. The level of ROS was determined using the dye 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), which is oxidized by free radicals to form fluorescent 2,7-dichlorofluorescein (DCF), by fluorescence microscopy, flow cytometry, and using a plate reader. The level of protein expression was determined by flow cytometry using specific antibodies. The level of gene expression was assessed by real-time polymerase chain reaction. It was shown that when the studied compounds are introduced into the cellular environment, they intensively absorb reactive oxygen species due to double conjugated bonds in the framework. At the same time, fullerene derivatives contribute to the development of secondary oxidative stress in cells 24 hours after administration. This effect occurs due to the activation of the NOX4 enzyme. In the cells of human embryonic lung fibroblasts, which were injected with the studied C60 fullerene derivatives, a correlation was found between the average value of the NOX4 enzyme protein and the level of reactive oxygen species. The lack of activation of the antioxidant transcription factor NRF2 upon incubation of human embryonic lung fibroblasts in the presence of C60 fullerene derivatives contributes to the development of secondary oxidative stress in cells.

 водорастворимые производные фуллерена C60 активные формы кислорода эмбриональные фибробласты легких человека окислительный стресс water-soluble derivatives of fullerene C60 reactive oxygen species human embryonic lung fibroblasts oxidative stress Работа выполнена при поддержке грантов РНФ: проект 19-13-00411-П (синтез Ф1 и Ф17) и проект 18-15-00437 П (влияние Ф1 и Ф17 на ФЛЭЧ).

Dugan L.L., Lovett E.G., Quick K.L., Lotharius J., Lin T.T., O'Malley K.L. Fullerene-based antioxidants and neurodegenerative disorders. Parkinsonism Relat Disord, 2001, vol. 7, no. 3, pp. 243-246. Dugan L.L., Lovett E.G., Quick K.L., Lotharius J., Lin T.T., O'Malley K.L. Fullerene-based antioxidants and neurodegenerative disorders. Parkinsonism Relat Disord, 2001, vol. 7, no. 3, pp. 243-246. Wolff D.J., Papoiu A.D., Mialkowski K., Richardson C.F., Schuster D.I., Wilson S.R. Inhibition of nitric oxide synthase isoforms by tris-malonyl-C(60)-fullerene adducts. Arch Biochem. Biophys., 2000, vol. 378, no. 2, pp. 216-223. Wolff D.J., Papoiu A.D., Mialkowski K., Richardson C.F., Schuster D.I., Wilson S.R. Inhibition of nitric oxide synthase isoforms by tris-malonyl-C(60)-fullerene adducts. Arch Biochem. Biophys., 2000, vol. 378, no. 2, pp. 216-223. Gharbi N., Pressac M., Hadchouel M., Szwarc H., Wilson S.R., Moussa F. [60] Fullerene is a powerful antioxidant in vivo with no acute or subacute toxicity. Nano Lett, 2005, vol. 5, pp. 2578-2585. Gharbi N., Pressac M., Hadchouel M., Szwarc H., Wilson S.R., Moussa F. [60] Fullerene is a powerful antioxidant in vivo with no acute or subacute toxicity. Nano Lett, 2005, vol. 5, pp. 2578-2585. Kraevaya O.A., Peregudov A.S., Troyanov S.I. et al. Diversion of the Arbuzov reaction: alkylation of C-Cl instead of phosphonic ester formation on the fullerene cage. Org Biomol Chem, 2019, vol. 17, no. 30, pp. 7155-7160. Kraevaya O.A., Peregudov A.S., Troyanov S.I. et al. Diversion of the Arbuzov reaction: alkylation of C-Cl instead of phosphonic ester formation on the fullerene cage. Org Biomol Chem, 2019, vol. 17, no. 30, pp. 7155-7160. Bisaglia M., Natalini B., Pellicciari R., Straface E., Malorni W., Monti D., Franceschi C., Schettini G.C3-fullero-trismethanodicarboxylic acid protects cerebellar granule cells from apoptosis. J Neurochem, 2000, vol. 74, pp. 1197-1204. Bisaglia M., Natalini B., Pellicciari R., Straface E., Malorni W., Monti D., Franceschi C., Schettini G.C3-fullero-trismethanodicarboxylic acid protects cerebellar granule cells from apoptosis. J Neurochem, 2000, vol. 74, pp. 1197-1204. Sergeeva V., Kraevaya O., Ershova E. et al. Antioxidant properties of fullerene derivatives depend on their chemical structure: a study of two fullerene derivatives on HELFs. Oxid Med Cell Longev, 2019, vol. 2019, p. 4398695. Sergeeva V., Kraevaya O., Ershova E. et al. Antioxidant properties of fullerene derivatives depend on their chemical structure: a study of two fullerene derivatives on HELFs. Oxid Med Cell Longev, 2019, vol. 2019, p. 4398695. Monti D., Moretti L., Salvioli S., Straface E., Malorni W., Pellicciari R., Schettini G., Bisaglia M., Pincelli C., Fumelli C., Bonafè M., Franceschi C. C60 carboxyfullerene exerts a protective activity against oxidative stress-induced apoptosis in human peripheral blood mononuclear cells. Biochem Biophys Res Commun, 2000, vol. 277, pp. 711-717. Monti D., Moretti L., Salvioli S., Straface E., Malorni W., Pellicciari R., Schettini G., Bisaglia M., Pincelli C., Fumelli C., Bonafè M., Franceschi C. C60 carboxyfullerene exerts a protective activity against oxidative stress-induced apoptosis in human peripheral blood mononuclear cells. Biochem Biophys Res Commun, 2000, vol. 277, pp. 711-717. Ershova E.S., Sergeeva V.A., Tabakov V.J. et al. Functionalized fullerene increases NF-κB activity and blocks genotoxic effect of oxidative stress in serum-starving human embryo lung diploid fibroblasts. Mutat Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen, 2016, vol. 805, pp. 46-57. Ershova E.S., Sergeeva V.A., Tabakov V.J. et al. Functionalized fullerene increases NF-κB activity and blocks genotoxic effect of oxidative stress in serum-starving human embryo lung diploid fibroblasts. Mutat Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen, 2016, vol. 805, pp. 46-57. Ershova E.S., Sergeeva V.A., Chausheva A.I. et al. Toxic and DNA damaging effects of a functionalized fullerene in human embryonic lung fibroblasts. Oxid. Med. Cell Longev, 2016, vol. 2016, p. 9895245. Ershova E.S., Sergeeva V.A., Chausheva A.I. et al. Toxic and DNA damaging effects of a functionalized fullerene in human embryonic lung fibroblasts. Oxid. Med. Cell Longev, 2016, vol. 2016, p. 9895245. Xiao L., Takada H., Gan X.h., Miwa N. The water-soluble fullerene derivative ‘Radical Sponge’ exerts cytoprotective action against UVA irradiation but not visible-light-catalyzed cytotoxicity in human skin keratinocytes. Bioorg Med Chem Lett, 2006, vol. 16, pp. 1590-1595. Xiao L., Takada H., Gan X.h., Miwa N. The water-soluble fullerene derivative ‘Radical Sponge’ exerts cytoprotective action against UVA irradiation but not visible-light-catalyzed cytotoxicity in human skin keratinocytes. Bioorg Med Chem Lett, 2006, vol. 16, pp. 1590-1595. Kornev A.B., Khakina E.A., Troyanov S.I., Kushch A.A., Peregudov A., Vasilchenko A., Deryabin D.G., Martynenko V.M., Troshin P.A. Facile preparation of amine and amino acid adducts of [60] fullerene using chlorofullerene C60Cl6 as a precursor. Chem. Commun, 2012, vol. 48, pp. 5461-5463. Kornev A.B., Khakina E.A., Troyanov S.I., Kushch A.A., Peregudov A., Vasilchenko A., Deryabin D.G., Martynenko V.M., Troshin P.A. Facile preparation of amine and amino acid adducts of [60] fullerene using chlorofullerene C60Cl6 as a precursor. Chem. Commun, 2012, vol. 48, pp. 5461-5463.