Фермент лакказа принадлежит к семейству медь-содержащих оксидаз. Лакказы эукариот состоят из трёх доменов, в бактериях, кроме трёхдоменных, существуют двухдоменные (малые) лакказы. Трёхдоменные лакказы в настоящее время применяются в промышленности, органическом синтезе, косметике и медицине. Двухдоменные лакказы начали исследоваться сравнительно недавно, они имеют более высокую термостабильность и устойчивость к высоким значениям рН, что может способствовать их использованию в различных отраслях производства. Объектом наших исследований являются малые лакказы рода Streptomyces - Streptomyces griseoflavus и S. viridochromogenes. Несмотря на высокую гомологию, эти белки обладают разной термостабильностью. На основе биоинформатического анализа этих лакказ мы определили аминокислотные остатки, предположительно, влияющие на большую термостабильность лакказы S. viridochromogenes . Была получена мутантная форма лакказы S. griseoflavus (SgSLmut) с заменой трёх метиониновых аминокислотных остатков на лейцины. Мы предположили, что эти замены приведут к уплотнению гидрофобного ядра молекулы белка и повышению термостабильности лакказы, поскольку в соответствующих положениях более термостабильной лакказы S. viridochromogenes вместо метионинов находятся лейцины. Тем не менее, биофизические исследования показали, что SgSLmut обладает меньшей термостабильностью, чем белок дикого типа. Для контроля данных биофизических исследований нами были получены кристаллы мутантного белка и дифракционные данные с них. Анализ структуры мутантной формы лакказы показал меньшую заселенность ионами меди Т2 / Т3 центров. Мы предположили, что понижение термостабильности белка может быть связано с дестабилизацией структуры тримера лакказы из-за уменьшения содержания меди в Т2 / Т3 кластере. Выращивание биомассы штамма-суперпродуцента в среде с повышенным содержанием меди привело к насыщению медью Т2 / Т3 кластера и повышению термостабильности SgSLmut до уровня белка дикого типа.
лакказы, мутагенез, пространственная структура, медь-содержащие центры
1. Skálová T., Dohnálek J., Østergaard L.H., Østergaard P.R., Kolenko P., Dušková J., Štěpánková A., Hašek J. The structure of the small laccase from Streptomyces coelicolor reveals a link between laccases and nitrite reductases. J Mol Biol., 2009. vol. 385, pp. 1165-1178.
2. Trubitsina L.I., Tishchenko S.V., Gabdulkhakov A.G, Lisov A.V., Zakharova M.V., Leontievsky A.A. Structural and functional characterization of two-domain laccase from Streptomyces viridochromogenes. Biochimie, 2015, vol. 112, рp. 151-159.
3. Tishchenko S., Gabdulkhakov A., Trubitsina L., Lisov A., Zakharova M., Leontievsky A. Crystallization and X- ray diffraction studies of a two-domain laccase from Streptomyces griseoflavus. Acta Crystallogr. Sect. F Biol. Commun., 2015, vol. 71, рp.1200-1204.
4. Kabsch W. Integration, Scaling, Space-Group Assignment and Post-Refinement. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, 2010, vol. 66 (2), pp. 133-144.
5. McCoy A.J., Grosse-Kunstleve R.W., Adams P.D., Winn M.D., Storoni L.C., Read R.J. Phaser crystallographic software. J. Appl. Cryst., 2007, vol. 40, pp. 658-674.
6. Murshudov G.N. [et al.] REFMAC5 for the Refinement of Macromolecular Crystal Structures. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, 2011, vol. 67 (4), pp. 355-367.
7. Аdams P.D. [et al.] PHENIX: A Comprehensive Python-Based System for Macromolecular Structure Solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, 2010, vol. 66 (2), pp. 213-221.
8. Emsley P., Lohkamp B., Scott W.G., Cowtan K. Features and Development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, 2010, vol. 66 (4), pp. 486-501.
9. Ducros V., Brzozowski A.M., Wilson K.S., Brown S.H., Ostergaard P., Schneider P., Yaver D.S., Pedersen A.H., Davies G.J. Nat Struct Biol., 1998, vol. 5, pp. 310-316.
10. Galhaup С., Haltrich D. Enhanced formation of laccase activity by the white-rot fungus Trametes pubescenes in the presence of copper. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, vol. 56, pp. 225-232.
