МТТ-анализ - один из наиболее используемых методов определения выживаемости клеток в культуре при различных фармакологических воздействиях. Внутриклеточные дегидрогеназы восстанавливают МТТ (3-(4,5-диМетилТиазол-2-ил)-2,5-дифенилТетразолий бромид) до формазана, который сильно поглощает свет области короче ~600нм. Формазан образует агрегаты и обнаруживается в клетках по появлению темных «зерен». В настоящей работе выполнено исследование влияния МТТ на митохондриальный потенциал (ΔΨm) и поглощение света в культивируемых нейронах мозжечка крысы методами световой микроскопии. Изменения потенциала регистрировали с помощью флуоресцентного потенциал-чувствительного зонда родамин 123 (Rh123). Добавление МТТ (0,1мМ) вызывало быстрое и практически полное тушение флуоресценции Rh123, которое через 5-10 мин сменялось ростом флуоресценции в нуклеоплазме. Зонд выходил из митохондрий в цитозоль с последующей диффузией в ядро, что является характерным признаком падения ΔΨm. Столь же быстрым было тушение флуоресценции митотрекера зеленого (MTG), которое не сменялось ростом флуоресценции, поскольку MTG связывается с митохондриями необратимо. Рост флуоресценции Rh123 совпадал с началом снижения интенсивности света, проходящего сквозь клетки, в результате образования формазана. МТТ вызывал также необратимое снижение автофлуоресценции нейронов, обусловленной NADH. Восходящая фаза сигнала Rh123 и снижение интенсивности проходящего сквозь клетки света отражает, вероятно, прекращение окисления NADH комплексом 1 дыхательной цепи вследствие того, что NADH тратится на восстановление МТТ до формазана. В итоге прекращается работа комплекса 1 дыхательной цепи и развивается деполяризация митохондрий. Полученные результаты указывают на то, что МТТ (при концентрациях 0,1мМ и выше) вызывает быструю дисфункцию митохондрий и поэтому следует относиться с осторожностью к интерпретации данных о выживаемости клеток и активности дегидрогеназ на основании количества формазана, образовавшегося при инкубации клеточных культур с МТТ.
нейроны, митохондриальный потенциал, флуоресцентная микроскопия, МТТ
1. Bellamy W.T. Prediction of response to drug therapy of cancer. A review of in vitro assays. Drugs. 1992, vol. 44, no. 5, pp. 690-708.
2. Galluzzi [et al.] Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ., 2009, vol. 16, no. 8, pp.103-107.
3. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods., 1983, vol. 65, pp. 55-63.
4. Denizot F., Lang R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability J. Immunol. Methods, 1986, vol. 89, pp. 271-277.
5. Duchen M.R., Surin A.M., Jacobson J. Imaging mitochondrial function in intact cells. Methods in Enzymology, 2003, vol. 361, pp. 353-389.
6. Khodorov B. Glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurones. Prog. Biophys. Mol. Biol., 2004, vol. 86, no. 2, pp. 279-351.
7. Lukyanova L.D. Mitochondrial Signaling in Hypoxia. Open Journal Endocrine Metabolic Diseases, 2013, vol. 3, pp. 20-32.
8. Сурин А.М., Горбачева Л.Р., Струкова С.М., Пинелис В.Г., Сторожевых Т.П. Флуоресцентно-микроскопические методы оценки функционального состояния и выживаемости нейронов. Руководство к экспериментальным работам по физиологии, 2009, с. 141-187. [Surin A.M., Gorbacheva L.R., Strukova S.M., Pinelis V.G., Storozhevykh T.P. Fluorescence microscopy methods for assessing functional status and survival of neurons. Guide to the experimental work on the physiology, 2009, pp.141-187. (In Russ.)]
9. Berridge M.V., Tan A.S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Arch Biochem Biophys, 1993, vol. 303, no. 2, pp. 474-482
10. Goodwin C.J., Holt S.J., Riley P.A. [et al.] Growth hormone-responsive DT-diaphorase-mediated bioreduction of tetrazolium salts, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, vol. 226, pp. 935-941.
11. Tarpey M.M., Fridovich I. Methods of Detection of Vascular Reactive Species Nitric Oxide, Superoxide, Hydrogen Peroxide, and Peroxynitrite. Circ. Res., 2001, vol. 89, pp. 224-236.
12. Bernas T., Dobrucki J.W. The role of plasma membrane in bioreduction of two tetrazolium salts, MTT, and CTC. Arch. Biochem. Biophys. 2000, vol. 380, pp. 108-116.
13. Liu Y., Peterson D.A., Kimura H., Schubert D. Mechanism of cellular 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction, J. Neurochem. 1997, vol. 69, pp. 581-593.
14. Stepanenko A.A., Dmitrenko V.V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene, 2015, vol. 574, no. 2, pp. 193-203.
15. Grela E., Ząbek A., Grabowiecka A. Interferences in the optimization of the MTT assay for viability estimation of proteus mirabilis. Avicenna J Med Biotechnol., 2015, vol. 7, no. 4, pp. 159-167.
16. Ward M.W., Rego A.C., Frenguelli B.G., Nicholls D.G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells, J Neurosci, 2000, vol. 20, no. 19, pp. 7208-7219.
17. Buckman J.F., Hernández H., Kress G.J., Votyakova T.V., Pal S., Reynolds I.J. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. J Neurosci Methods, 2001, vol. 104, no. 2, pp. 165-176.
18. Marshall N.J., Goodwin C.J., Holt S.J. A critical assessment of the use of microculture tetrazolium assays to measure cell growth and function. Growth Regul., 1995, vol. 5, pp. 69-84.
19. Нарциссов Р.П. Анализ изображения клетки - следующий этап развития клинической цитохимии в педиатрии. Педиатрия. Журнал им. Г.Н.Сперанского, 1998, т. 77, № 4, с. 101-105. [Narcissov R.P. Analysis of cell imaging - the next stage of clinical cytology in pediatrics. Pediatriya. Zhurnal im. G.N. Speranskogo, 1998, vol. 77, no. 4, pp. 101-105 (In Russ.)]
20. Nicholls D.G., Budd S.L. Mitochondria and neuronal survival, Physiol. Rev., 2000, vol. 80, pp. 315-360.
21. Закиров Р.Ш., Сорокина Е.Г., Карасёва О.В., Семёнова Ж.Б., Петричук С.В., Рошаль Л.М., Пинелис В.Г. Функциональное состояние митохондрий лимфоцитов периферической крови при черепно-мозговой травме у детей. Вестник РАМН, 2015. [Zakirov R.S., Sorokina E.G., Karaseva O.V., Semenova Zh.B., Petrichuk S.V., Roshal L.M., Pinelis V.G. Peripheral blood lymphocytes mitochondrial functional in children with traumatic brain injury. Vestnik RAMN, 2015 (In Russ.)]
