Мы показали, что люцифераза светляка, продуцируемая клетками E.coli , является чувствительным маркером для изучения температурного воздействия на жизнеспособность живых клеток. Люцифераза экспрессируется в растворимой и активной форме, что позволяет непосредственно в клетках измерять ее ферментативную активность по свечению клеток без их разрушения. При этом интенсивность свечения высокая, свечение длительное - регистрация сигнала возможна в течение нескольких минут без существенного снижения интенсивности. Кинетические и термодинамические параметры термоинактивации люциферазы в клетках E. сoli оказались сходными с аналогичными параметрами для очищенного фермента в буферной системе; в обоих случаях инактивация фермента подчиняется кинетике первого порядка независимо от микроокружения. Скорость термоинактивации внутриклеточной люциферазы практически такая же, что и скорость снижения жизнеспособности клеток (КОЕ/мл), определенная методом посевов. При этом при воздействии температуры энергетический статус клеток, оцениваемый по содержанию внутриклеточного АТФ меняется по более сложным законам. В частности, показано увеличение содержания АТФ в течение первых 20 мин нагревания клеточной суспензии.
люмифераза светлячков, биолюминесценция, термическая инактивация, E.coli BL21, жизнеспособность клеток, тепловое напряжение
1. Smelt J. P. P. M., Brul S. Thermal Inactivation of Microorganisms. Critical Reviews. Food Science and Nutrition, 2014, vol. 54, pp. 1371-1385.
2. Li H., Gänzle M., Some Like It Hot: Heat Resistance of Escherichia coli in Food. Front. Microbiol. , 2016, vol. 7, pp. 1763-1769.
3. Ugarova N.N. Luciferase of Luciola mingrelica fireflies. Kinetics and regulation mechanism. J. Biolumin. Chemilumin., 1989, vol. 4, pp. 406-418.
4. Chart H., Smith H.R., La Ragione R.M. and Woodward M.J. An investigation into the pathogenic properties of Escherichia coli strains BLR, BL21, DH5a and EQ1. J. Applied Microbiol., 2000, vol. 89, pp. 1048-1058.
5. Lomakina G.Yu, Modestova Yu.A., Ugarova N.N. Bioluminescence Assay for Cell Viability. Biochemistry, vol. 80, no. 6, pp. 701-713.
6. Dement`eva E.I., Ugarova N.N., Cobbold P.H., Assay of ATP in intact Escherichia coli expressing recombinant firefly luciferase. Biochemistry, vol. 61, pp. 915-920.
7. Koksharov M.I., Ugarova N.N., Thermostability enhancement of Luciola mingrelica firefly luciferase by in vivo directed evolution. Luminescence, 2010, vol.25, pp.135-136.
