Исследование посвящено поиску новых информативных параметров для экспериментального определения структурных перестроек белков. Для этого было проведено сравнение кривых перехода, получаемых по характеристикам собственной флуоресценции белков при стационарных (непрерывное возбуждение) и время-разрешенных условиях (импульсное наносекундное возбуждение). Исследована равновесная денатурация мочевиной двух белков - карбоксиангидразы Б быка и бактериальной люциферазы, содержащих по семь триптофановых остатков. Проанализирована зависимость от концентрации мочевины следующих параметров флуоресценции: сдвиг спектра испускания при стационарных условиях, времена жизни, вклад спектральных компонент, ассоциированных с определённым временем жизни. Получено, что в случае карбоксиангидразы характеристики стационарной флуоресценции не отражают стадийность процесса денатурации, в отличие от параметров время-разрешенной флуоресценции. Это может быть связано с тем, что промежуточные состояния данного белка образуются при близких значениях концентрации мочевины. Стадии денатурации бактериальной люциферазы значительно разнесены по концентрации денатурирующего агента, поэтому они находят отражение, как в стационарных спектрах флуоресценции, так и в изменениях времен жизни. Обсуждается связь наблюдаемых различий в параметрах флуоресценции белков с локализацией их триптофановых остатков и общим механизмом денатурации.
собственная флуоресценция белков, равновесная денатурация, карбоксиангидраза Б, бактериальная люцифераза, время жизни флуоресценции, путь денатурации белка
1. Lakowicz J.R. Principles of fluorescence spectroscopy. New York: Springer Science, 2006.
2. Chen Y., Barkley M.D. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry, 1998, vol. 37, pp. 9976-9982.
3. Albani J.R. Origin of tryptophan fluorescence lifetimes. Part 1. Fluorescence lifetimes origin of tryptophan free in solution. J. Fluoresc., 2014, vol. 24, pp. 93-104.
4. Albani J.R. Origin of tryptophan fluorescence lifetimes. Part 2: Fluorescence lifetimes origin of tryptophan in proteins. J. Fluoresc., 2014, vol. 24, pp. 105-117.
5. Engelborghs Y. The analysis of time resolved protein fluorescence in multi-tryptophan proteins. Spectrochim. Acta A., 2001, vol. 57, pp. 2255-2270.
6. Semisotnov G.V., Uversky V.N., Sokolovsky I.V., Gutin A.M., Razgulyaev O.I., Rodionova N.A. Two slow stages in refolding of bovine carbonic anhydrase B are due to proline isomerization. J. Mol. Biol., 1990, vol. 213, pp. 561-568.
7. Melnik B.S., Marchenkov V.V., Evdokimov S.R., Samatova E.N., Kotova N.V. Multy-state protein: Determination of carbonic anhydrase free-energy landscape. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2008, vol. 369, pp. 701-706.
8. Semisotnov G.V., Rodionova N.A., Kutyshenko V.P., Ebert B., Blanck J., Ptitsyn O.B. Sequential mechanism of refolding of carbonic anhydrase B. FEBS Lett., 1987, vol. 224, pp. 9-13.
9. Inlow J.K., Baldwin T.O. Mutational analysis of the subunit interface of Vibrio harveyi bacterial luciferase. Biochemistry, 2002, vol. 41, pp. 3906-3915.
10. Deeva A.A., Temlyakova E.A., Sorokin A.A., Nemtseva E.V., Kratasyuk V.A. Structural distinctions of fast and slow bacterial luciferases revealed by phylogenetic analysis. Bioinformatics, 2016, vol. 32, pp. 3053-3057.
11. Ameloot M., Hendrickx H. Extension of the performance of Laplace deconvolution in the analysis of fluorescence decay curves. Biophys. J., 1983, vol. 44, pp. 27-38.
12. Beechem J.M., Gratton E., Ameloot M., Knutson J.R., Brand L. The global analysis of fluorescence intensity and anisotropy decay data: second-generation theory and programs In Topics in fluorescence spectroscopy, Springer, Boston, MA, 2002, pp. 241-305.
13. Nemtseva E.V., Lashchuk O.O., Gerasimova M.A. Similarity of decay-associated spectra for tryptophan fluorescence of proteins with different structures. Biophysics, 2016, vol. 61, pp. 193-199.
14. Nemtseva E.V., Lashchuk O.O., Gerasimova M.A., Melnik T.N., Nagibina G.S., Melnik B.S. Fluorescence lifetime components reveal kinetic intermediate states upon equilibrium denaturation of carbonic anhydrase II. Methods and applications in fluorescence, 2018, vol. 6, pp. 015006.
15. Reshetnyak Y.K., Koshevnik Y., Burstein E.A. Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. III. Correlation between fluorescence and microenvironment parameters of individual tryptophan residues. Biophys. J., 2001, vol. 81, pp. 1735-1758.
16. Shen C., Menon R., Das D. [et al.] The protein fluorescence and structural toolkit: Database and programs for the analysis of protein fluorescence and structural data. Proteins, 2008, vol. 71, pp. 1744-1754.
17. Deeva A.A., Nemtseva E.V., Kratasyuk V.A. Structural properties of tryptophan microenvironment in bacterial luciferase. Luminesc., 2014, vol. 29, pp. 72-73.
18. Slyusareva E.A., Gerasimovа M.A., Sizykh A.G., Gornostaev L.M. Spectral and fluorescent indication of the acid-base properties of biopolymer solutions. Russ. Phys. J., 2011, vol. 54, pp. 485-492.
19. Tsuboi T., Penzkofer A., Slyusareva E., Sizykh A. Photoluminescence properties of fluorone dyes in bio-related films at low temperatures. J. Photochem. Photobiol. A., 2011, vol. 222, pp. 336-342.
