Разработан эффективный подход к продукции практически нерастворимых гидрофобных белков в стабильной растворимой форме. Предложенный метод основан на получении слитых белков, включающих целевые белки и белок-носитель. В качестве носителя использован белок GrAD - апикальный домен термофильного шаперона GroEL. Для обеспечения возможности отделения белка-носителя путем избирательного гидролиза бромцианом был создан безметиониновый вариант GrAD. Изучены слитые белки с целевыми белками, соединенными с C-концом белка-носителя и слитый белок с целевым белком, соединенным с N-концом белка-носителя. Слитые белки экспрессированы в E. coli при различных температурах, они преимущественно образовывали тельца включения. Все слитые белки после растворения телец включения в растворе мочевины были успешно ренатурированы в стабильной растворимой форме. Изучена их стабильность и функциональность. GrAD как носитель может быть платформой для получения самых разных гидрофобных белков в растворимой форме для их исследования.
стабилизация белков, гидрофобные белки, шапероны, минишаперон
1. Arakawa T., Timasheff S.N. Theory of protein solubility. Methods Enzymol., 1985, vol. 114, p. 49-77.
2. Schein C.H. Solubility as a function of protein structure and solvent components. Biotechnol. Nat. Publ. Co., 1990, vol. 8, no. 4, pp. 308-317.
3. Hjelmeland L.M., Chrambach A. Solubilization of functional membrane proteins. Methods Enzymol., 1984, vol. 104, pp. 305-318.
4. Kinsella J.E., Morr C.V. Milk proteins: physicochemical and functional properties. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 1984, vol. 21, no. 3, pp. 197-262.
5. Ferreira L. [et al.] Properties and crystallization of a genetically engineered, water-soluble derivative of penicillin-binding protein 5 of Escherichia coli K12. Eur. J. Biochem., 1988, vol. 171, no. 1-2, pp. 11-16.
6. Hatefi Y., Hanstein W.G. Solubilization of particulate proteins and nonelectrolytes by chaotropic agents. Proc. Natl. Acad. Sci., 1969, vol. 62, no. 4, pp. 1129-1136.
7. Helenius A., Simons K. Solubilization of membranes by detergents. Biochim. Biophys. Acta BBA-Rev. Biomembr., 1975, vol. 415, no. 1, pp. 29-79.
8. Clark P. Protein folding in the cell: reshaping the folding funnel. Trends Biochem. Sci., 2004, vol. 29, no.10, pp. 527-534.
9. Fedorov A.N., Baldwin T.O. GroE modulates kinetic partitioning of folding intermediates between alternative states to maximize the yield of biologically active protein1. J. Mol. Biol., 1997, vol. 268, no. 4, pp. 712-723.
10. Smoot A.L. [et al.] The Binding of Bis-ANS to the Isolated GroEL Apical Domain Fragment Induces the Formation of a Folding Intermediate with Increased Hydrophobic Surface Not Observed in Tetradecameric GroEL. Biochemistry (Mosc.), 2001. vol. 40, no. 14, pp. 4484-4492.
11. Pettersen E.F. [et al.] UCSF Chimera - a visualization system for exploratory research and analysis. J. Comput. Chem., 2004, vol. 25, no. 13, pp. 1605-1612.
12. Sharapova O.A., Yurkova M.S., Fedorov A.N. A minichaperone-based fusion system for producing insoluble proteins in soluble stable forms. Protein Eng. Des. Sel., 2016, vol. 29, no. 2, pp. 57-64.
13. Kyte J., Doolittle R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol., 1982, vol. 157, no. 1, pp. 105-132.
14. Mallon R.G., Wojciechowicz D., Defendi V. DNA-binding activity of papillomavirus proteins. J. Virol., 1987, vol. 61, no. 5, pp. 1655-1660.
