Лакказы (EC 1.10.3.2) - широко распространённые в природе «голубые» медьсодержащие оксидоредуктазы, являются перспективным объектом для биотехнолологической индустрии. Субстратами этих ферментов являются различные фенольные соединения, лакказы обнаружены в высших растениях, некоторых насекомых, грибах и бактериях. Лакказы содержат четыре атома меди, организованные в 3 сайта: Т1, Т2 и Т3. В бактериях, наряду с трёхдоменными лакказами, имеются двухдоменные лакказы (2DLac), которые имеют ряд функциональных преимуществ. 2DLac активны в нейтральных и щелочных значениях рН, обладают повышенной термостабильностью и устойчивы к действию различных ингибиторов. Каталитический механизм двухдоменных лакказ интенсивно изучается, однако, принципы субстрат/продуктного транспорта до сих пор не вполне понятны. В данной работе представлен сравнительный анализ каталитической активности и кристаллических структур рекомбинантной 2DLac из Streptomyces griseoflavus Ac-993 и её мутантных форм с заменами His165 на Phe и Ala. Консервативный для 2DLac His165 принадлежит второй координационной сфере и располагается близко к поверхности белка. Мы предполагаем, что движение имидазольного кольца His165 может «открывать» или «закрывать» один из субстрат-продуктных каналов, ведущих к Т2/Т3 центру лакказы S. griseoflavus .
двухдоменные лакказы, Streptomyces griseoflavus, кристаллические структуры, Т2/Т3 центр, субстратные каналы
1. Solomon E.I., Sundaram U.M., Machonkin T.E. Multicopper Oxidases and Oxygenases. Chem. Rev., 1996, vol. 96, pp. 2563-2606.
2. Bento I., Martins L.O., Gato Lopes G., Arménia Carrondo M., Lindley P.F. Dioxygen reduction by multi-copper oxidases; a structural perspective. Dalt. Trans., 2005 vol. 4, p. 3507, DOIhttps://doi.org/10.1039/b504806k.
3. Skálová T., Dohnálek J., Østergaard L.H., Østergaard P.R., Kolenko P., Dušková J., et al. The Structure of the Small Laccase from Streptomyces coelicolor Reveals a Link between Laccases and Nitrite Reductases. J. Mol. Biol., 2009, vol. 385, pp. 165-1178, DOI:https://doi.org/10.1016/j.jmb.2008.11.024.
4. Trubitsina L.I., Tishchenko S.V., Gabdulkhakov A.G., Lisov A.V., Zakharova M.V., Leontievsky A.A. Structural and functional characterization of two-domain laccase from Streptomyces viridochromogenes. Biochimie, 2015, vol. 112, pp. 151-159, DOI:https://doi.org/10.1016/j.biochi.2015.03.005.
5. Tishchenko S., Gabdulkhakov A., Trubitsina L., Lisov A., Zakharova M., Leontievsky A. Crystallization and X-ray diffraction studies of a two-domain laccase from Streptomyces griseoflavus. Acta Crystallogr. Sect. Struct. Biol. Commun., 2015, vol. 71, pp. 1200-1204, DOI:https://doi.org/10.1107/S2053230X15014375.
6. Kabsch W. Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr., 2010, vol. 66, pp. 133-144, DOI:https://doi.org/10.1107/S0907444909047374.
7. McCoy A.J., Grosse-Kunstleve R.W., Adams P.D., Winn M.D., Storoni L.C., Read R.J. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr., 2007, vol. 40, pp. 658-674, DOI:https://doi.org/10.1107/S0021889807021206.
8. Murshudov G.N., Skubák P., Lebedev A.A., Pannu N.S., Steiner R.A., Nicholls R.A., et al., REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr., 2011, vol. 67, pp. 355-367, DOIhttps://doi.org/10.1107/S0907444911001314.
9. Adams P.D., Afonine P.V., Bunkóczi G., Chen V.B., Davis I.W., Echols N., et al. PHENIX: A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr., 2010, vol. 66, pp. 213-221, DOI:https://doi.org/10.1107/S0907444909052925.
10. Emsley P., Lohkamp B., Scott W.G., Cowtan K. Features and development of Coot, Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr., 2010, vol. 66, pp. 486-501, DOI:https://doi.org/10.1107/S0907444910007493.
11. Pavelka A., Sebestova E., Kozlikova B., Brezovsky J., Sochor J., Damborsky J. CAVER: Algorithms for Analyzing Dynamics of Tunnels in Macromolecules, IEEE. ACM Trans. Comput. Biol. Bioinforma, 2016, vol. 13, pp. 505-517, DOI:https://doi.org/10.1109/TCBB.2015.2459680.
12. Vaguine A.A., Richelle J., Wodak S.J., et al. SFCHECK : a unified set of procedures for evaluating the quality of macromolecular structure-factor data and their agreement with the atomic model. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr., 1999, vol. 55, pp. 191-205, DOIhttps://doi.org/10.1107/S0907444998006684.
13. Gabdulkhakov A.G., Kostareva O.S., Kolyadenko I.A., Mikhaylina A.O., Trubitsina L.I., Tishchenko S.V. Incorporation of Copper Ions into T2/T3 Centers of Two-Domain Laccases. Mol. Biol., 2018, vol. 52, DOIhttps://doi.org/10.1134/S0026893318010041.
14. Jones S.M., Solomon E.I. Electron Transfer and Reaction Mechanism of Laccases. Cell Mol Life Sci., 2015, vol. 72, pp. 869-883, DOIhttps://doi.org/10.1007/s00018-014-1826-6.Electron.
15. Komori H., Kataoka K., Tanaka S., Matsuda N., Higuchi Y., Sakurai T. Exogenous acetate ion reaches the type II copper centre in CueO through the water-excretion channel and potentially affects the enzymatic activity. Acta Crystallogr. Sect. Struct. Biol. Commun., 2016, vol. 72, pp. 558-563, DOI:https://doi.org/10.1107/S2053230X16009237.
16. Polyakov K.M., Gavryushov S., Ivanova S., Fedorova T. V., Glazunova O.A., Popov A.N., et al., Structural study of the X-ray-induced enzymatic reduction of molecular oxygen to water by Steccherinum murashkinskyi laccase: insights into the reaction mechanism. Acta Crystallogr. Sect. D Struct. Biol., 2017, vol. 73, pp. 388-401, DOI:https://doi.org/10.1107/S2059798317003667.
